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技术支持

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常见问题解答

分子生物学

Q:

怎样处理特殊大小的细胞?

A:

有的细胞特别大或特别小,特别是一些原代细胞,还有的细胞成团无法计数。对于这种细胞,从预实验开始就会有所不同。预实验时,保持感染时细胞的汇合率达到30~40%,即使细胞没有预定的10000 个/孔的数目,正式实验的细胞汇合率应尽量控制在这个数量。对于成团的细胞,如胰岛细胞,胚胎干细胞等,应注意细胞团的数目和大小,以便以后的实验按比例放大。

Q:

加入病毒后,目的细胞死亡很多,为什么?

A:

Lentivirus可能对您的目的细胞有一定的毒性,请调整并降低感染的MOI值,并且在感染4 h、8 h、12 h后对细胞进行换液,用新鲜的完全培养液继续培养观察。

Q:

目的细胞可以被Lentivirus感染,但是GFP荧光强度很低,为什么?

A:

目的细胞中GFP荧光强度取决于病毒感染细胞的颗粒数、细胞本身的增殖状态、细胞类型以及观察时间等。一般来讲,目的细胞感染病毒颗粒数越多,细胞本身增殖越快,GFP荧光会较强。Lentivirus属于慢病毒,一般在增殖较快的细胞中病毒感染48~72h后,GFP基因表达才达到高峰。对于增殖较慢的细胞,GFP基因表达时间还会延长。

Q:

Lentivirus对目的细胞的感染效率很低,如何提高病毒的感染效率?

A:

一般我们通过提高MOI值来提高病毒的转染效率,必要时可在培养液中加入Polybrene (4~10 µg/mL)来提高病毒的感染率。同时,目的细胞良好的生长状态是获得正常感染效率的保证。

Q:

常见细胞推荐的MOI

A:

常见细胞推荐的MOI

Q:

Lentivirus在细胞水平的使用

A:

艾基提供的Lentiviral Vector Particle为VSVG膜蛋白包裹的,虽然与其他的膜蛋白相比,它能够感染的细胞种类大大增加,但是对不同的细胞和组织的感染性仍有差别。在使用Lentivirus之前请查阅相关文献,了解这种Lentivirus对目的细胞的亲嗜性,复感染指数(MOI值)以及在体内(in vivo)注射所需要的病毒量。如果没有相关文献支持,则需要检测病毒对目的细胞的亲嗜性。实际上即使有文献支持,但因为不同实验的细胞代数,个体差异,细胞状态的关系,细胞实际的MOI和文献报道的往往会有差异。因此,正式实验前一般会安排预实验,以了解细胞所需MOI以及病毒对细胞状态和传代的影响。1. 目的细胞感染预实验 说明:MOI值:感染复数或复感染指数,是“mui…

Q:

Lentivirus使用安全注意事项

A:

艾基提供的慢病毒载体属于“第二代”慢病毒载体,其基因组的3’ LTR的增强子功能发生了缺失,从而形成了所谓的“自灭活”(Self-inactivation,SIN),即该病毒基因组整合到细胞基因组后,不会产生新的子代病毒,也降低了对周围基因的意外激活,因此具有较好的安全性。但该病毒仍然具有可能的潜在的生物学危险,所以建议不要使用编码已知或可能会致癌的基因的假型病毒。除非已经完全公认某个基因肯定没有致癌性,否则均不建议采用假型病毒进行生物学实验,如有疑问,请与我们联系。使用时请参照如下所示进行实验:1. 病毒操作时请使用生物安全柜(BSL-2)。2. 病毒操作时请穿实验服,戴口罩和手套。3. 操作病毒时应小心,避免产生气溶胶,如果操作…

Q:

Lentivirus的储存与稀释

A:

1. 收到病毒液后4℃保存(请于一周内用完),如需长期保存则存放于-80℃。避免反复冻融,否则会降低病毒滴度,一般病毒可以存放于-80℃约6个月。6个月后使用,请重新检测病毒滴度。2. 艾基提供的Lentivirus溶于HBSS中 (pH7.4) 。病毒使用时,请将病毒从-80℃冰箱取出,冰浴融化,4℃存放。如有需要稀释病毒,则可加入适量的HBSS混匀使用,也可以用培养液进行稀释。3. “TU/mL”:Transducing Units,转导单位,表示可以感染并进入到目标细胞群中的病毒基因组数。艾基提供的慢病毒单位标识为TU/mL时,即每毫升慢病毒溶液中含有具有生物活性的慢病毒颗粒数。如:病毒滴度>1×10∧8 TU/mL,即每毫升病毒液中至少含有1×10∧8个具有生物活性的病毒颗…

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