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技术支持

致力于引进国外先进技术,为广大科研工作者和医疗机构提供高质量 的科研技术支持 。

常见问题解答

基因合成

Q:

质粒上有两个polyA序列,一个是BGHpA,一个是SV40pA,这两个有什么区别?

A:

BGHpA是牛生长因子polyA(BGH聚腺苷酸化信号序列):可以有效终止转录和mRNA聚腺苷酸化的牛生长因子(BGH)聚腺苷酸化信号序列,多聚腺苷酸尾(或聚A尾)保护mRNA,免受核酸外切酶攻击,并且对转录终结、将mRNA从细胞核输出及进行翻译。而SV40pA是猴空泡病毒polyA(SV40早期poly-A信号序列)以及SV40晚期poly (A)序列。SV40 PolyA(猴空泡病毒PolyA,简称PolyA)序列是有转录终止作用和使转录的mRNA添加PolyA尾的DNA序列(240 bp),含有AATAAA六核苷酸多腺苷化信

Q:

我想用真核细胞表达我的基因片段,假如我的基因片段插在多克隆位点上,但是多克隆位点与真核启动子之间隔了一个原核的T7启动子,就是我的目的基因与启动子之间隔了一个原核的启动子,这样我的基因还能表达吗?

A:

某些真核表达载体上同时存在CMV启动子和T7启动子例如:在pcDNA3.1/myc-His系列载体中CMV启动子位于209~863,而T7启动子则位于863~882,这样目的基因就可以在含有T7 RNA 聚合酶基因的宿主菌表达。在宿主细菌细胞或体外转录中,质粒DNA可以利用T7启动子驱动基因表达,而在哺乳动物细胞中,转基因表达由CMV启动子驱动。而T7 启动子在这个商业化载体pCDNA3.1(+)中常被用于测序。所以,若是使用真核载体pCDNA3.1(+)或者pCDNA3.1(-)的话,一般情况下是不会影响基因的表达。

Q:

请问你们的细菌有T7 polymerase可以直接在该细菌上表达克隆基因的吗?

A:

具有T7 polymerase的表达菌株,本司常备有BL21(DE3)和BL21(pLysS)两种表达菌株: BL21(DE3):表达克隆于含有噬菌体T7启动子的表达载体(如pET系列)的非毒性基因。 BL21(pLysS):pLysS含有表达T7溶菌酶的基因,适合表达毒性蛋白和非毒性蛋白。

Q:

密码子优化过的基因,艾基生物是否还提供蛋白表达服务?

A:

艾基生物同时可为合成的基因提供蛋白表达及纯化服务。艾基生物提供四大蛋白表达系统:原核蛋白表达系统、酵母蛋白表达系统、杆状病毒-昆虫细胞蛋白表达系统及哺乳动物细胞蛋白表达系统。若需要订购蛋白表达服务,会有相关业务员跟进关于蛋白纯白条件摸索以及蛋白纯化等等工作以及报价。

Q:

艾基生物是否免费提供自备载体验证服务?

A:

在艾基生物订购质粒构建服务,可为您免费提供一个反应(正常情况下可测序验证插入的MCS区域)的载体测序验证服务。若测序验证由于您提供的样品或样品信息出现问题时,需要加测反应,则有您承担加测费用。

Q:

提供的质粒量太少了,能不能多提供一些?

A:

客户在下订单的时候可以自行标注多所需要发货量,我们尽量满足合理范围内所有要求

Q:

如何使用艾基生物基因合成或克隆构建交付的项目样品,交付的项目样品类型都有哪些?

A:

如您在艾基生物订购基因合成、克隆构建、定点突变等质粒构建的项目,将会为您提供经测序验证的质粒1-2ug,含重组质粒的新鲜菌液和甘油菌。 A. 质粒· 样品形式为液体,含有少量的Tris-Hcl,不影响测序和酶切。一般高拷贝载体浓度在100-250ng/μl,而低拷贝载体浓度在50-100ng/μl,具体见标签上注明的浓度,提供总量约1~2ug。· 使用方法:可以直接进行酶切和测序,也可进行转化(用量为0.5 ul~1 ul)。· 保存:建议-70℃长期保存。B. 新鲜菌液· 样品形式为新鲜菌液(不含甘油),可接种于新鲜的培养液中37℃过夜培养后直接提取质粒。· 菌株为Match-T1,JM109,DH10B,该菌株为非甲基化缺陷型菌株,使用限制性内切酶处理样品时,甲基化敏感型酶的活…

Q:

基因合成服务提供的数据报告包含哪些文件,每个文件需要使用什么软件打开?

A:

您所收到的基因合成服务数据报告是ZIP格式的压缩文件,可以使用Winrar(4.0以上版本)打开,数据报告一般含有7类文件,包含测序原始图谱、序列比对文件和质粒图谱及序列。分别为: 1. *.abl 文件为 ABI 3730 序列图谱,是测序结果的峰图文件,可使用 Chromas 或其它相关软件查看。 Chromas 软件可在以下地址免费下载: http://www.technelysium.com.au/chromas_lite.html 2. *.seq 文件为*.abl 峰图文件对应的序列文件,可以使用 TXT 文档等相关软件打开。 3. *.cm5 文件为您的质粒图谱,该文件必须使用 Clone Manager 5 及以上版本查看及编辑。 4. 如果您无法使用 Clone Manager,我们为您提供了一个*.gbk 文件,该文件为 genbank 格式,包含了您的…

Q:

在大肠杆菌表达系统中,哪种终止密码子具有偏好性?在哺乳动物系统中呢?

A:

在大肠杆菌中,TAG很少用;经常使用的是TAA;TGA也可以。在哺乳动物中,TGA的使用频率高于TAA和TAG。相对于哺乳动物和大肠杆菌之间的不同,密码子使用表在哺乳动物不同有机体间的区别不是很大。

Q:

如想在两种不同的宿主中表达目的蛋白,艾基生物是否能够在两种宿主中进行优化?

A:

可以。我们的优化工具可以帮助您同时针对两个不同宿主物种进行基因优化。该工具可同时载入两个宿主的密码子偏向性和顺势作用元件等优化参数,双宿主优化算法会搜寻两个宿主表达的平衡点,以求在两个宿主中都可以得到令人满意的蛋白表达量。但是在两个宿主物种的亲缘关系比较远等情况下,双宿主基因优化则很有可能在两个宿主中都得不到理想的优化结果。如果您在您的双宿主优化结果中发现了CAI小于0.80,大量顺势作用元件没有被过滤掉,或其他可能影响基因表达的现象,我们推荐您针对两个宿主分别使用我们的单一宿主优化方法。

Q:

如需基因优化,我需要提供哪些信息?

A:

若需基因优化,我们需要您提供如下信息:a.被优化的基因序列或者蛋白序列;b.优化的宿主(物种,例如:人、小鼠、茄子等等);c.基因两端需添加的酶切位点或者基因内部需避免的酶切位点;d.是否需要特定的终止密码子;e.是否需添加Kozak序列,对于哺乳动物表达系统我们一般建议您添加Kozak序列。

Q:

密码子优化有必要吗?

A:

对于用于蛋白表达的基因来说,多数情况下是有必要的。如真核生物的基因需要在原核生物中表达。由于真核生物的密码子偏好和原核生物有很大不同,对基因进行密码子优化将显著提高表达效率。

Q:

构建后的质粒以及项目相关信息,艾基生物会保留吗?会保留多久?

A:

您的实验数据、质粒及甘油菌艾基生物将为您保存1个月,请您拿到样品后尽快验证实验结果。

Q:

订购定点突变项目,需要提供什么信息?为什么突变一个点,收费会比目录价更贵?

A:

需提供改造前载体的相关信息(质粒图谱、全序列、多克隆位点、克隆位点上下游50 bp序列的验证结果),并注明突变的氨基酸序列以及突变位点。若突变的序列较长或无适合的酶切位点,会按照克隆长度进行分析报价,相对而已收费比目录价更贵一些。

Q:

订购克隆构建项目,需要提供什么信息?

A:

需要您明确告知克隆要求,并确保提供信息的正确性。需提供改造前载体的相关信息(质粒图谱、全序列、多克隆位点、克隆位点上下游50 bp序列的验证结果),并注明使用时是否有特殊要求;模板相关信息(模板类型、模板序列、模板验证结果);构建后的质粒信息(构建后质粒命名、构建后质粒序列)

Q:

艾基生物可以将合成的基因克隆至我指定的载体吗?

A:

可以。但如非艾基生物常备的其它的载体需要由客户自己提供。如果您需要将合成的基因克隆到您指定的载体上,需要您提供载体相关信息(质粒图谱、全序列、多克隆位点、克隆位点上下游50bp序列的验证结果),若无法提供测序结果,我司会提供测序验证的服务,我们会根据目的基因的长度,载体构建的难度加收部分亚克隆费用(除部分免克隆费的载体)。

Q:

pGSI载体和其他免费克隆载体什么区别?在什么情况下,艾基生物建议使用pGSI载体?

A:

艾基生物基因合成服务为客户免费提供pGSI,pBluescript II SK(-),pUC19,pUC57,pcDNA3.1(+) 5种克隆载体。pGSI是由pBluescript II SK改造过的, 除去了它的多酶切克隆位点,只保留SmaI、EcoRV、XhoI 3种克隆位点。如客户对克隆载体和克隆位点没有特殊要求,我们将会默认把目的基因片段平端克隆到pGSI的SmaI位点。如果客户要求避免一些载体上常用的酶切位点以方便后续的亚克隆需求,我们可保证构建后的质粒上不出现指定的酶切位点。

Q:

艾基生物能合成多长的基因?

A:

没有长度限制,艾基生物可为您合成长达10 kb及以上的基因序列。且艾基生物已挑战合成成功的基因有:长达30 kb的基因(分段组装);>90%高GC含量或<10%高AT含量的基因;重复片段基因;强二聚体结构的基因;含50多个连续腺嘌呤的基因 (aaaaaaa……)等几千种复杂基因。

Q:

艾基生物基因合成服务的优势有哪些?

A:

艾基生物基因合成服务主要竞争优势:①基因合成平台:可以合成任何基因,包括高度重复(正向/反向)序列、AT/GC rich 序列、发夹结构、连续单一碱基重复等富含特殊结构的复杂基因、毒性基因等②特殊的克隆策略:采用无缝隙克隆组装技术,可将合成的基因插入到任意载体的任一位置。③客户信息安全保证:艾基生物基因合成周期短,特有的安全制度保证客户的信息安全,公司严格按照与客户签定的基因合成服务协议和保密合同执行服务;④良好的客户信任度:服务质量可靠,提供DNA测序结果,保证所合成的基因序列100%准确。艾基生物为客户合成的许多基因以及提供的密码子优化后序列合成,在其发表的高水平文章中得到引用。

Q:

与传统PCR克隆相比,基因合成有什么优点?

A:

基因合成有如下优点:①专业的密码子优化技术提高了蛋白的表达量及可溶性;②成本效益低,通过普通PCR克隆方法构建组织特异性cDNA文库是费时费钱的;③基因合成获得的基因无突变、准确,普通PCR产生非预期结果的可能性大,从而影响后续实验的进行;④不需要依赖模板以及载体酶切位点的限制。

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